再创丨爱丁堡大学王宝俊团队开发首例“类真核”细菌CRISPRa
研究团队亦以此项工作向真核RNA聚合酶发现50周年致敬。长按扫描二维码可以访问文章原文或者直接访问原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-019-11479-0
——文章第一作者作者，爱丁堡大学博士生刘阳
编辑：孟凡康
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CRISPR系统的可编程性自从被揭示以来，就成为各种基因工程改造的热门对象。其中，一类巧妙利用CRISPR系统可编程性的工程学课题便是利用CRISPR实现特定基因的表达调控。
相对于利用CRISPR系统抑制基因的转录或翻译过程，CRISPR激活（CRISPRa）工具的设计更为复杂，往往需要部分“征用”宿主细胞自身的基因激活机制加以工程化改造。在真核生物中，这类工具已经具备十分完善的功能【1】。然而，原核生物中的CRISPR激活性能则一直受到局限，这主要与原核生物基因激活调控机制的可选范围有关。基于σ70因子的基因激活机制大部分不适于与CRISPR系统结合，而基于其它类型σ因子的基因激活机制则相对复杂或缺乏充分研究，难以进行设计和利用。因此在细菌中，此前仅有两类基于σ70因子的CRISPRa系统被报道，且存在激活靶点区域狭窄，激活输出倍率低等局限【2, 3】。
近日，英国爱丁堡大学王宝俊团队在Nature Communications发表长文EngineeredCRISPRa enables programmable eukaryote-like gene activation in bacteria（刘阳为第一作者），报导了第一种“类真核”的原核CRISPR基因激活装置，该研究利用了原核生物中σ54因子的一种特殊“闭锁技能”，实现了高质量的CRISPR激活调控【4】。
图2：2019年8月26日文章在线发表于Nature Communications期刊
σ54因子是细菌中广泛存在的一类σ因子，主要调控一些细菌细胞不需要时刻表达的基因，如环境响应基因等。这类基因往往涉及一些具有重要研究或应用价值的生物学功能，如致病性、密度感应、生物固氮、生物膜形成等等【5-7】。这些基因的转录在不需要表达时可以被σ54因子非常严格地关闭，以避免造成细胞能量和基因表达资源被浪费。σ54因子的这种特殊能力使得σ54因子依赖型启动子的激活调控具有泄漏表达低，激活输出倍率高的优点。
σ54因子依赖型激活也被称为“类真核”激活，因为这一过程受到一个远离启动子核心序列的上游增强子控制。具有ATP水解酶活性的激活子可以结合到增强子序列，并通过DNA成环远程“解锁”σ54因子，进而允许转录起始——这个机制很像真核细胞中RNA聚合酶II的转录起始机制。
王宝俊老师在σ54基因调控领域具有丰富的研究经验，他在2011年发表的经典合成生物学成果中曾经利用σ54依赖型启动子构建了逻辑门线路【8】。这次，通过结合现有的sgRNA支架设计和一种已被证明模块性较高的σ54因子依赖型激活子PspF【9, 10】，其研究团队成功在模式生物Escherichia coli和固氮菌Klebsiella oxytoca中实现了类真核CRISPR激活，并且激活装置具有泄漏表达水平低，激活倍率高等优异的调控性能。经过进一步的工程化改造和优化，其基因调控性能第一次达到了足以构建CRISPRa级联调控、CRISPRa正反馈调控和多通道基因调控的水平上。
由于这一工具良好的调控正交性、高激活倍率以及低泄漏表达，王宝俊团队进一步设计出了一种具有工业应用前景的多基因表达谱筛选工具。
多基因表达线路常常应用在人工代谢途径的构建中，特定的基因表达比例往往有利于宿主细胞高效合成目标代谢产物，达到生长繁殖与工业生产的最佳平衡状态。这种基因表达比例关系所形成的“表达谱”往往需要通过筛选以得到最优结果，传统方法是构建代谢途径线路的文库以进行有效筛选。
文库的设计和构建是一个繁琐耗时的过程，王宝俊团队巧妙地利用CRISPR调控优异的多通道调控能力，将基因表达比例关系从代谢途径线路上分离出来，转换为多种sgRNA的转录比例关系（多sgRNA转录谱）。新型CRISPRa装置可以将各种sgRNA转录谱高质量地“投影”到目标代谢线路上。一个包含sgRNA转录谱多样性的多通道sgRNA发生器文库，可以被用于各种经过标准化设计的目标代谢途径线路上，生成多样的多基因表达谱以用于进一步的筛选。更重要的是，这个过程中表达谱的投影强度是可诱导调控的，足以灵活地避免待筛选线路在合成中或筛选过程中造成的毒性或宿主细胞生长、代谢负担。
对此，文章第一作者作者，爱丁堡大学博士生刘阳说到：“这就像可回收火箭，不再需要为了一个载荷建造整支火箭。科学家也不再需要为了筛选不同代谢线路的表达谱反复构建文库，而可以仅合成一个初始状态为OFF的多基因线路，再使用一个可以大规模生产的通用文库赋予目标线路各种各样的表达谱。”
参考文献
1. Qi,L.S., Larson, M.H., Gilbert, L.A., Doudna, J.A., Weissman, J.S., Arkin, A.P.& Lim, W.A. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173-1183 (2013).
2. Bikard,D., Jiang, W.Y., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F. & Marraffini, L.A.Programmable repression and activation of bacterial gene expression using anengineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41, 7429-7437 (2013).
3. Dong,C., Fontana, J., Patel, A., Carothers, J.M. & Zalatan, J.G. SyntheticCRISPR-Cas gene activators for transcriptional reprogramming in bacteria. NatCommun 9：2489 (2018).
4. LiuY, Wan X, Wang B Engineered CRISPRa enables programmable eukaryote-like geneactivation in bacteria, Nat Commun10:3693(2019).
5. Jovanovic, M., James, E.H., Burrows, P.C.,Rego, F.G., Buck, M. & Schumacher, J. Regulation of the co-evolved HrpR andHrpS AAA+ proteins required for Pseudomonassyringae pathogenicity. Nat Commun2:177 (2011).
6. Wolfe, A.J., Millikan, D.S., Campbell, J.M.& Visick, K.L. Vibrio fischeri σ54 controls motility, biofilm formation, luminescence, and colonization. Appl Environ Microbiol 70, 2520-2524 (2004).
7. Charlton,W., Cannon, W. & Buck, M. The KlebsiellaPneumoniae Nifj Promoter - Analysis of Promoter Elements RegulatingActivation by the NifA Promoter. MolMicrobiol 7, 1007-1021 (1993).
8. Wang,B., Kitney, R.I., Joly, N. & Buck, M. Engineering modular and orthogonalgenetic logic gates for robust digital-like synthetic biology. Nat Commun 2:508 (2011).
9. Zhou, Y., Asahara, H., Schneider, N., Dranchak,P., Inglese, J. & Chong, S. Engineering bacterial transcription regulationto create a synthetic in vitro two-hybrid system for protein interactionassays. J Am Chem Soc 136, 14031-14038 (2014).
10. Ma, H., Tu, L.C., Naseri, A., Huisman, M.,Zhang, S., Grunwald, D. & Pederson, T. Multiplexed labeling of genomic lociwith dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol 34,528-530 (2016).
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